Mezinárodní konference Action Duchenne 2020 – genová terapie a editace genů

Metody používané ve výzkumu:

• Western blot – zjišťuje se množství a velikost proteinů.
• Imuno-fluorescence – umožní zobrazit místo v buňce, kde se sledovaný protein nachází.

Genová terapie

Snahou genové terapie je dostat funkční kopii genu pro dystrofin do svalových buněk, aby došlo k obnovení tvorby proteinu dystrofinu. Momentálně se mimo jiné k dopravení genu do svalových buněk používají adeno-asociované viry (AAV).  Zde  není snahou opravit mutaci v DNA, ale dáme buňce k dispozici gen bez mutací. AAV je kapsida (schránka) a ta nese námi vložený genetický kód. AAV se po nitrožilní aplikaci musí ideálně dostat do všech jader svalové buňky (vlákna) kosterní svaloviny. Výhodou AAV je, že ve většině případech nevyvolávají symptomy a jsou snadné pro přípravu. Dále dokáží zacílit přímo na svalové buňky. Limitem je kapacita AAV a celý gen pro dystrofin se sem nevejde a proto se do nich vkládá zkrácený gen pro mikro-dystrofin. Mikro-dystrofin není tak účinný jako úplný dystrofin, nicméně genová terapie je schopná zajistit dokonce větší množství mikro-dystrofinu, než množství dystrofinu, které přirozeně mají lidé s BMD, takže je naděje, že větší množství mikro-dystrofinu by mohlo do určité míry vykompenzovat svou nižší účinnost. Další nevýhodou je, že imunitní systém může virus odmítnout, nicméně AAV vektory jsou zatím nejlepší možnost. Probíhají studie s lipidovými nanočásticemi, které by mohly být lepší a nahradit AAV. U DMD dochází k opakujícím se cyklům degenerace a zhoršené svalové regenerace a geny při AAV terapii neintegrují do tkáně, takže další generace buněk již nebude ovlivněna terapií a výzkumníci se z tohoto důvodu zabývají otázkou, kdy ve vývoji dítěte je nejvhodnější čas pro podstoupení léčby. AAV terapii nejde opakovat – pokud například dítě dostane při terapii dávku, která není dostačující, opakování této terapie nedokáže nahradit tento nedostatek. Doplnit předchozí nedostatečnou dávku následující dávkou je možné např. u terapie antisense oligonukleotidy.

Klinické studie genové terapie s AAV:

Pfizer – Fáze 1b studie bezpečnosti s C3391001 (předběžné výsledky). Porovnávaly se dvě skupiny pacientů s tím, že každá skupina užívala dávku o jiné kvantitě. Výsledky testů posouzení chůze (NSAA) u dvou pacientů: 1. pacient – zlepšení o 3 body na stupnici, 2. pacient – zlepšení o 6 bodů. U dvou účastníků se objevily závažné vedlejší účinky, nevolnost a akutní poškození ledvin, a následně došlo k návratu do normálu.
SOLID Biosciences – Fáze I/II s SGT-001. Zde se také porovnávaly dvě skupiny s odlišným dávkováním. Nicméně objevily se vedlejší účinky v podobě sníženého množství krevních destiček a to v takové míře, že FDA musela studii pozastavit. SOLID Biosciences poté přišli s plánem pro zmírnění vedlejších účinků a FDA povolila pokračovat.
Sarepta – V této studii se použila jedna předem určená optimální dávka (rAAVrh74.MHCK7.micro-dystrophin). Studie jednoznačně potvrdila vysokou tvorbu mikro-dystrofinu. Hladina kreatinkinázy poklesla o 46-85%. Vedlejší účinky: nevolnost.

Vedlejších účinky:

Většina pacientů toleruje terapii s AAV dobře. Relativně časté vedlejší účinky: symptomy podobné chřipce a zvýšená hladina transamináz. Méně časté vedlejší účinky: trombocytopenie, zvýšení hladiny troponinu, atypický hemolyticko-uremický syndrom

Editace genů

Editace genů spočívá v opravě DNA přímo v buňce. Využívá se k tomu aparát CRISPR (úseky prokaryotické DNA), který je přirozeně přítomen v buňkách jako obranný mechanismus. Často se pro CRISPR používá označení ‚molekulární nůžky‘, jelikož je schopen rozštěpit DNA přesně v daném místě. S CRISPERem  můžeme provádět změny v genomu a opravit mutace. Při terapii přesto může docházet k nežádoucímu štěpení ale dlouhodobé nežádoucí účinky nejsou zatím známy. Klinický výzkum v oblasti editace genů je dosud zatím nejvíce zakládán na terapii „ex-vivo“, což spočívá v získání kmenových buněk od pacienta, načež mimo tělo pacienta se v těchto buňkách provede korekce daných genů a tyto již vyléčené kmenové buňky se pak aplikují pacientovi do svalu, kde potom produkují dystrofin. Momentální omezení spočívá v nedostatku efektivních svalových kmenových buněk, které by se byly schopny spolehlivě dopravit na dané místo ve svalu.

Klinické studie:

Leonela Amoasii et al. (2018) založili studii s genovou terapií na přístupu „in-vivo“ a použili k tomu AAV vektory u psů s mutací, která může být léčena přeskočením exonu 51. Byla zjištěna poměrně výrazná tvorba dystrofinu. Tato technika by mohla být aplikovatelná i na srdeční svalovinu.
Dětská nemocnice (SickKids), jenž je přidružená k Universitě v Torontu, je nemocnicí v Kanadě s intenzivnějším výzkumem. Probíhá zde i vývoj terapie založené na CRISPR/Cas9. V jejich laboratoři se zaměřují hlavně na studium genových delecí a duplikací u DMD, což představuje celkem 80% všech mutací v dystrofinovém genu. Výzkumný tým zde použil speciálně upravenou myš s duplikací exonů 18 až 30 v genu dystrofinu. Kromě svalové biopsie sledovali také celkový pohyb myši a stav srdce pomocí EKG. Odstranění duplikace bylo provedeno zacílením CRISPERu na místo ve zdvojeném regionu, kde po odstranění nadbytečné části DNA došlo k opětovnému spojení. Pro dopravení CRISPERu (zde jednovláknová gRNA/Cas9) použili vektory AAV9. Výsledkem bylo velice efektivní obnovení tvorby kompletního dystrofinu. To potvrdila svalová biopsie a pohybové testy. Dále to potvrdilo zachování srdeční funkce. Tento postup je aplikovatelný na všechny duplikace u DMD. Potencionální léčba by spočívala v jednorázové aplikaci, která by navždy opravila mutaci. Předtím, než se tak stane, je třeba ještě vyřešit možné vedlejší účinky a odpověď imunitního systému.

Otázky:

Bude CRISPR v budoucnu používán pro léčbu dětí a dospělých?
Určitě ano.
Je možné použít CRISPR pro kmenové buňky svalu?
Je důležité zacílit na kmenové buňky, jelikož ty budou s postupem času schopny plně zregenerovat poškozené svaly. Jelikož srdeční svalovina nepodléhá cyklům degenerace a regenerace, terapie cílená na srdce bude mít dlouhotrvající efekt bez nutnosti použití kmenových buněk.
Může být CRISPR použit i pro léčbu ostatních mutací?
CRISPR bude možné použít pro navržení individuální léčby pro každého. Laboratoř v Kanadě také pracuje na terapii, která je z části založena na metodě přeskočení exonů pro léčbu delecí. CRISPR může být aplikován na mnoho mutací.
Jak dlouho bude trvat než začnou klinické testy s CRISPeRem také u lidí?
Pro některé nemoci momentálně probíhají klinické testy s CRISPeRem i u lidí a to na základě přístupu ‚ex-vivo‘. Nedávno začala studie s CRISPeRem, ve které se látka přímo aplikuje do oka u osoby s formou slepoty. I přesto, že CRISPR může být v těle dlouhodobě přítomen, tak zatím nevíme o tom, že by došlo k nežádoucímu rozštěpení míst v genomu.

Sdílet: